Spektrofotometr – Jak to działa ? cz.1

Kilka miesięcy temu na naszym blogu znalazł się wpis dotyczący budowy spektrofotometru oraz zasady działania. W związku z dużym zainteresowaniem tematem postanowiliśmy przybliżyć i rozszerzyć wiedzę dotyczącą budowy spektrofotometru oraz jego zasady działania.

Czym jest spektrofotometr? Z jakich elementów jest zbudowany?  Na co należy zwrócić uwagę, wybierając urządzenie? Oraz jakie próbki możemy na nim mierzyć. Po odpowiedzi na te i wiele innych pytań zapraszam do artykułu poniżej.

Spektrofotometria jest powszechnie używaną metodą oznaczania obecności i stężenia substancji w próbce. Spektrofotometryczne oznaczenie stężenia substancji w roztworze na podstawie absorbancji roztworu opiera się na prawie Lamberta-Beera.

Zasada działania jest następująca: wiązka światła przechodzi przez pryzmat lub siatkę dyfrakcyjną. Odpowiednia długość fali bądź zakres fal wybierany jest przez przepuszczanie rozproszonego światła przez szczelinę. Następnie światło przechodzi przez próbkę w kuwecie i pada na detektor. Dzięki temu można, zarejestrować spektrometryczny odcisk palca badanej próbki, zależny od substancji zawartej w próbce.

Stężenie substancji jest jednym z czynników wpływających na ilość pochłanianego światła. Drugim jest długość drogi, jaką światło pokonuje, przechodząc przez próbkę, co warunkowane jest szerokością kuwety pomiarowej. Ostatnią jest współczynnik ekstynkcji tej substancji. Podstawowe prawo, na którym opiera się spektrofotometria, jest to wspomniane wcześniej prawo Lamberta Beera, które określa zależność pomiędzy przepuszczalnością lub pochłanianiem i trzema wymienionymi czynnikami. Zgodnie z tym prawem intensywność światła przepuszczonego (transmitancja) przez roztwór badany zmniejsza się wykładniczo, jeśli zwiększy się każdy z trzech czynników.

Elementami składowymi spektrofotometru jest źródło światła, monochromator, miejsce umieszczenia próbki i wzorca oraz fotodetektor. Poniżej dokładniej opiszemy każdy element.

1) Źródło światła.
Wybierając spektrofotometr źródło światła, jak i również jego zakres działania, jest jednym z podstawowych parametrów. Lampy używane w naszych spektrofotometrach działają w dwóch zakresach:
-UV (światło nadfioletowe) ? od 190 nm do 380 nm ? które pozwalają mierzyć : stężenie białka, DNA, RNA itp.
-VIS (światło widzialne) od 360 nm do 1100 nm ? które pozwalają na pomiar stężenia barwnych substancji, stężenia barwników itp.
W przypadku zakresu UV w naszych spektrofotometrach używane są lampy deuterowe, w zakresie VIS lampy halogenowo ? wolframowe.

W przypadku wyboru źródła światła w naszym spektrofotometrze należy zwrócić uwagę na:
-Jasność lampy w całym zakresie długości fali;
-Stabilność źródła światła w czasie;
-Długi okres zużywania się lampy;
-Niski koszt części zamiennych.

Ciężko jest pogodzić te wszystkie właściwości źródła światła w jednej lampie, ale wiedząc, czego oczekujemy, nasz wybór jest prosty.

 

Lampy halogenowo-wolframowe
Zasada działania lampy halogenowej jest taka sama jak w przypadku standardowej domowej żarówki. Energia elektryczna dostarczana jest do włókna, które nagrzewa się i emituję światło. Lampa wewnątrz wypełniona jest gazem, który stabilizuję wolfram wewnątrz włókna, co pozwala na stworzenie jasnego źródła światła o długiej żywotności. Żarówki wolframowo-halogenowe, zapewniają długą żywotność ok. 2000 h pracy oraz stosunkowo niski koszt.

Lampy deuterowe
Lampa deuterowa jest źródłem światła dzięki rozładowaniom, w której wnętrze wypełnione jest deuterem pod ciśnieniem. Rozkład widma w tych lampach obecny jest głównie w ultrafiolecie. Jednak lampy deuterowe charakteryzują się niższą żywotnością, będąc stabilnym źródłem światła.

Monochromator
Monochromator ma za zadanie wybrać, z emitowanego przez źródło ciągłego promieniowania, wąskie pasmo o wybranej długości fali i przepuścić je przez kuwetę zawierającą badaną substancję.
Monochromator składa się z:

  • Szczeliny wejściowej
  • Kolimatora
  • Elementu rozszczepiającego promieniowanie,
  • Szczeliny wyjściowej

Światło składa się z różnych długości fali i można je podzielić w zależności od ich długości.
Białe światło jest mieszaniną fal świetlnych o różnych długościach fali (380nm-780nm), światło zielone (około 540nm), czerwone (około 650 nm). Zasadę działania monochromatora można wyjaśnić, ukazując działanie pryzmatu, w którym rozbijane są promienie słoneczne.
Załamanie światła na jej składowe długości fali podobnej do tęczy jest znane jako dyspersja, a element o tej własności jest nazywany elementem dyspersyjnym. Pryzmat jest typowym elementem dyspersyjnym. Kolejnym jest siatka dyfrakcyjna. Białe światło świeci na siatkę dyfrakcji i odbijane jest w kolorach tęczy. W ten sam sposób, jak pryzmat, siatka dyfrakcyjna może być obracany w celu zmiany koloru światła wydobytego przez szczelinę.Monochromator zawiera element dyspersyjne, szczelinę wejściową i lustra, aby stworzyć równoległą wiązkę, a także szczelina wyjścia i lustra, aby wyodrębnić światło monochromatyczne.

Pozdrawiamy, biosens.pl

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie będzie publikowany. Zaznaczone pola są obowiązkowe *

*